▲ NIMH 이사의 혁신 연사 시리즈 : 중추 신경계 장애에 대한 치료법 발전  © 장애인인식개선신문

(서울=장애인인식개선신문) = 미국 정신건강연구소 이사의 혁신 연사 시리즈 : 중추 신경계 장애에 대한 치료법 발전

 

사본

>> ALEXANDER DENKER: 안녕하세요. 제 이름은 알렉산더 덴커입니다. NIMH를 대표하여 Beverly Davidson 박사를 이번 달의 Directors Innovation Series 연사로 맞이하게 된 것을 매우 기쁘게 생각합니다.

 

Davidson 박사는 필라델피아 아동 병원의 세포 및 분자 치료 센터 소장이자 최고 과학 전략 책임자이며 소아과의 Arthur Meigs 의장을 맡고 있습니다. 그녀는 또한 펜실베니아 대학의 Perelman School of Medicine의 병리학 및 실험실 의학과 교수이자 새로운 유전자 치료법을 시장에 출시하기 위해 설립 된 CHOP의 생명 공학 회사 인 Spark Therapeutics, Inc.의 공동 설립자입니다. 이 연구는 신경퇴행성 장애의 분자적 기초를 이해하고 유전성 뇌 질환을 치료하기 위한 새로운 치료법 개발에 중점을 두고 있습니다. 그녀는 낭포성 섬유증 및 기타 유전 질환에 대한 유전자 치료 센터의 부소장입니다. 그녀의 강연 제목은 "중추신경계 장애에 대한 치료법의 발전"입니다. 환영합니다, 데이비슨 박사님.

 

>> 비벌리 데이비슨: 알렉산더, 친절한 소개를 해주셔서 대단히 감사합니다. 오늘 이 자리에 서게 되어 기쁩니다. 그리고 뇌를 위한 유전자 치료와 특히 신경퇴행성 질환에 대한 응용에 대한 우리의 연구 중 일부를 공유하고자 합니다. 그리고 저는 오늘 제가 여러분과 공유하는 내용 중 일부가 정신 건강 장애에 대한 유전자 요법 사용을 구상하기 시작할 때 적용 가능하다는 것을 알게 되기를 바랍니다. 

 

 

이것은 나의 공개입니다. Alexander가 간략하게 언급했듯이. 그래서 저는 제 발표의 첫 번째 부분을 5-프라임 UTR에서 3-프라임 UTR에 이르기까지 게놈의 다양한 영역에서 반복 확장으로 인해 발생하는 다양한 유전 질환을 포괄하는 반복 확장 장애에 초점을 맞추고 싶습니다. 헌팅턴병과 척추 소뇌 운동실조증에 대한 코딩 축삭에서 볼 수 있는 더 작은 확장. 전능신교의 경우, 폴리글루타민 반복질환의 경우, 헌팅턴 및 척추 소뇌 운동실조증과 같은 독성 기능 기전의 이득이다. 그래서 아이디어는 독성 단백질과 그것을 암호화하는 메신저 RNA의 존재를 줄이는 방법론을 개발하고자합니다.

 

거기에는 여러 가지 다른 접근 방식이 있습니다. 이 모든 것을 읽지는 않겠지만 다양한 그룹이 분해를 향상시키기 위해 돌연변이 단백질을 표적으로 삼고 있다는 것을 아는 것이 중요하다고 생각합니다. 예를 들면 프로테오솜으로 양치기하는 것이 포함됩니다. 

 

최근까지 여러 가지 접근 방식이 있습니다. 안티센스 ASO와 관련된 클리닉에 있었습니다. 일부 사람들이 알고 있듯이 Roche가 주도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 프로그램과 치료제는 이후 보류되어 더 이상 진행되지 않습니다. 비대립유전자 특이적 방식으로 RNA 간섭을 사용하는 임상 시험이 있으며, 이는 아마도 전사체의 감소를 제공할 것이며 이것이 HD 환자와 치료적으로 관련이 있기를 희망합니다. 그러나 

오늘 제가 집중하고 싶은 것은 단백질이나 RNA를 쫓는 것이 아니라 실제로 이 독성 돌연변이 대립유전자를 암호화하는 DNA에 대해 생각하는 것입니다. 이를 위해 저는 CRISPR CAS 접근법에 초점을 맞추고 싶은데, 이는 현재 펜실베니아 대학의 조교수 인 Alex Mas Monteys의 실험실의 선임 과학자가 주도했습니다. 알렉스와 내가 CRISPR Cas 유전자 편집에 대해 생각했을 때, 여기서 우리는 유전자 발현을 억제하거나 돌연변이 헌팅턴을 암호화하는 실제 유전자에서 결실을 일으킬 것입니다. 

 

그리고 전사체를 표적으로 하는 RNA 간섭 및 ASO와 달리 우리는 돌연변이 유전자의 결실에 초점을 맞춰야 하는 위치에 대해 생각하는 것이 매우 중요하다고 생각했습니다. Joe Bait의 연구실과 David House의 연구실에서 나온 두 개의 최근 논문이 있었는데, 그들은 함께 헌팅턴의 첫 번째 축삭 내에서 비정상적인 스플라이싱을 식별하기 위해 협력했습니다. 이것은 폴리글루타민 반복 영역과 물론 확장된 폴리글루타민 반복 영역을 포함하는 헌팅턴 영역입니다. 

 

그들이 발견한 것은 엑손 1 내에서 이 대안적인 스플라이싱이 그 자체로 병원성일 수 있는 이 돌연변이 엑손 1 단백질의 발현이 있는 단편을 생성할 수 있다는 것입니다. 데이비드와 줄리의 연구 외에도 로라 랜덤 (Laura Random)의 연구실에서 발견 된 바에 따르면, 그녀는 이러한 반복 확장 영역이 다른 미세 위성 질환에서 발생하는 것과 유사하며, 이러한 반복 확장은 실제로 비정상적인 전사 및 번역을 일으킬 수 있음을 확인했습니다. 

 

이는 ATG에 독립적이기 때문에 RAN 변환이라고 합니다. 그리고 RNA 또는 암호화된 단백질에 관계없이 이러한 독성 제품도 HD 내의 병원성 후유증에 기여할 수 있습니다.

 

이를 염두에 두고 우리가 결정한 것은 돌연변이 대립유전자를 살펴보고 돌연변이 대립유전자의 상류와 축삭 1의 상류 및 프로모터 영역에 매우 가까운 5개의 프라임 UTR의 하류를 스캔하고 직접 편집을 허용하는 PAM 모티프를 생성하는 돌연변이 대립유전자와 연결된 단일 뉴클레오티드 다형성을 찾는 것이었습니다. 

 

다행스럽게도 우리는 대립 유전자 특이적 편집을 위한 핸들을 제공할 돌연변이 대립 유전자와 연결된 것으로 보이는 많은 SNP를 발견했습니다. 따라서 업스트림 PAM과 다운스트림 PAM을 결합하면 돌연변이 대립 유전자에서만 엑손 1 결실을 촉진하고 정상 대립 유전자는 그대로 두는 아이디어가 될 것입니다. 

 

우리는 먼저 HD 환자 샘플에서 조사된 많은 SNP를 포함하는 일반적인 세포주에서 테스트했습니다. 그래서 우리는 인트로 3 및 4 가이드 또는 업스트림 가이드 1-6 단계에서 볼 수 있듯이 다양한 가이드 쌍, 업스트림 가이드 및 다운스트림 인트로닉 가이드를 테스트했습니다. 

 

왼쪽에서 헌팅턴 발현 수준의 매우 효과적인 침묵을 볼 수 있으며 빨간색 화살표로 표시됩니다. 그리고 나서 오른쪽의 웨스턴 블롯에서 볼 수 있는 단백질의 동시 감소와 아래 하단 막대 그래프에서 정량화됩니다. 

 

이것은 고무적이었고 SNP가 유용하고 적극적인 편집에 사용될 수 있음을 시사했습니다. 그리고 다음으로 우리는 헌팅턴 감방으로 옮겼습니다. 그래서 이들은 SNP를 포함하는 헌팅턴 환자에서 유래 한 세포입니다. 아래에 인용 한 논문의 앞부분에 제시된 데이터의 작은 샘플을 보여 드리고 있습니다. 그래서 저는 이 방법을 사용하여 돌연변이 대립유전자를 선택적으로 편집할 수 있는 능력을 보여드리고자 합니다. 

 

그래서 여기 이 세포주에서 연결된 단일 뉴클레오티드 다형성을 가진 돌연변이 대립유전자에서 폴리글루타민 반복 확장이 있는 상황이 있습니다. intronic 3과 함께 SNP1에 대한 가이드 RNA를 적용하면 전사체 수준이 약 50% 감소하는 것을 볼 수 있습니다. 

 

그리고 웨스턴 블롯으로 보고 빨간색 화살표로 돌연변이 단백질을 보고 파란색 화살촉으로 정상 단백질과 비교하면 가이드 없이 처리된 대조군 세포에서 야생형 단백질에 대한 돌연변이의 상대적 수준을 볼 수 있으며, SNP 타겟팅 가이드를 추가하면 돌연변이 단백질의 수준이 선택적으로 감소하는 것을 볼 수 있습니다. 그리고 이것은 우리가 RNA에서 보았던 것과 매우 관련이 있으며, 다시 말하지만, 약 50 % 감소합니다. 생체 내에서는 어떻습니까? 

 

다행스럽게도 William Yang은 확장된 폴리글루타민 반복을 가진 전장 인간 유전자를 포함하는 HD 마우스 모델을 만들었고, 이 특정 대립 유전자에는 우리가 평가하는 데 관심이 있었던 많은 SNP도 있음이 밝혀졌습니다. 그래서 우리는 후보 가이드와 Cas 9를 재조합 RNA 바이러스로 포장하고 마우스 뇌의 한쪽에 주입 한 다음 치료되지 않은 쪽과 비교하여 뇌의 처리 된 쪽의 편집 수준을 비교했습니다. 

 

여기 왼쪽 하단의 첫 번째 패널에서 제가 보여드리는 것은 스플라이싱 분석에서 오른쪽 선조체에 바이러스가 주입된 것을 볼 수 있는 반면, 왼쪽 선조체와 바이러스가 이동하지 않는 꼬리 DNA에서는 음성 대조군으로 볼 수 있습니다. 

 

그 결과 오른쪽 선조체로의 단일 주입에서 인간 헌팅턴 mRNA 수준이 50% 감소했기 때문에 이는 매우 고무적입니다. 그래서 제가 여기에 제시하지 않은 이 데이터와 추가 데이터는 매우 효과적이라고 생각합니다.정상 단백질과 돌연변이 단백질을 모두 발현하는 세포를 취하여 돌연변이 단백질을 선택적으로 편집하여 이제 정상 헌팅턴만 포함하는 세포를 얻을 수 있습니다. 그리고 우리는 다른 사람들의 연구를 통해 정상적인 헌팅턴의 50 %가 뇌에서 잘 견디며 앞으로 해로운 일련의 사건을 일으키지 않을 것이라는 것을 알고 있습니다. 그래서 이것은 이상적인 상황이 될 것입니다. 

 

그러나 우리는 어디로 갈 것인가 - 우리는 어디로 갈 것인가? 그래서 세미나의 나머지 부분을 여러분께 보여드리고 싶은 몇 가지 사항이 있습니다, 우리가 이것을 클리닉으로 발전시키는 것에 대해 어떻게 생각하고 있는지. 하나는 AAV 타겟팅을 개선하는 것입니다. 

 

잠시 후에 그것에 대해 이야기하겠습니다. 다른 하나는 이 SNP의 단계적 단계화이며, 돌연변이 대 정상 대립 유전자에서 매우 널리 퍼진 단일 뉴클레오티드 다형성입니다. 그리고 오늘은 그 데이터를 보여드릴 시간이 없을 것입니다. 그리고 다른 하나는 AAV 제공 편집 기계의 안전성을 향상시키는 것입니다. 이것이 왜 중요하다고 생각합니까? 음, cas9는 박테리아 단백질입니다. 

 

그것은 인간 단백질이 아닙니다. 짧은 시간 동안만 편집하면 됩니다. 우리는 그것을 영원히 필요로하지 않습니다. 그래서 우리가 맥동적인 편집을 한 다음 약해지고 본질적으로 AAV 기계가 더 이상 필요하지 않을 때 세포에서 침묵하는 것이 이상적일 것입니다. 그렇다면 우리는 어떻게 그것을 달성 할 것인가? 저는 한 걸음 물러서서 우리가 어떻게 규제된 편집을 할 수 있게 되었는지 말씀드리겠습니다.

 

그래서 이를 위해 척수성 근위축증에 대해 잘 모르시는 분들을 위해 소개하고자 합니다. 그리고 척수성 근위축증의 중증도는 SMN2 유사유전자의 투여량과 관련이 있다는 사실. 인간은 SMN1 유전자와 SMN2 유전자를 가지고 있으며, SMN 환자는 SMN1에 돌연변이가 있습니다. 

 

그리고 SMN2의 여러 유사유전자가 있는 경우 유사유전자의 작은 부분이 올바르게 접합되기 때문에 SMN1을 기능적으로 보완할 수 있습니다. 그리고 실제로 승인된 약물과 임상 테스트 중인 약물이 엑손 7을 포함하도록 스플라이싱 수준을 향상시킬 수 있고 SMNA 환자에서 효능을 나타내는 약물이 있습니다. 사실, 이 두 약물은 경구 생체 이용률이 있습니다. 환자는 구두로 복용합니다. 

 

투약 중 일부는 다른 것보다 더 빈번합니다. 아시다시피, 일주일에 두 번 정도. 따라서 여기서 아이디어는 이러한 약물이 엑손 7 포함을 촉진하고 전장 SMN2의 발현을 허용할 수 있다면 이를 활용하고 SMN2 발현을 유도하는 대신 관심 유전자를 유도하면 어떨까요? 

 

이 경우 Cas 9. 그래서 유전자 치료의 조절된 제어를 위한 스플라이싱 스위치라고 부르는 것을 개발하는 첫 번째 예에서 우리는 이 SMN2 미니 유전자인 E6, E7, E8을 관심 유전자의 업스트림에 융합시켰고, 첫 번째 슬라이드에서는 많은 리포터 데이터를 보여드리겠습니다. 그리고 여기서 아이디어는 엑손이 포함되지 않을 때, 프레임 밖에서, 표현이 없을 때입니다. 

 

약물이 존재할 때, 그것은 프레임 안에 있고 단백질 합성이 있습니다. 그리고 실제로 포함 수준을 기준선의 야생형 수준인 10%가 아니라 1% 수준으로 변경할 수 있습니다. 그래서 우리는 이것이 유전자 발현을 조절하기 위해 무엇을 하는지 물었습니다.

 

그래서 우리는 스플라이싱 스위치의 다운스트림에 리포터를 복제했고, 약물이 없는 경우 이 기준선 수준을 볼 수 있으며 리포터 발현의 기준선 수준이 있습니다. 그러나 약물이 존재할 때 이 약물은 LMI070이며 유전자 발현 수준에서 약 <>배의 유도를 볼 수 있습니다. 이것은 또한 Branaplam뿐만 아니라 다른 슬라이드에서 보여준 다른 약물에도 효과가 있습니다. 

 

글쎄요, 이것은 발현의 <>배 증가였지만 우리의 우려는 이 기본 발현 수준이 너무 높다는 것이었습니다. 우리는 당신이 원한다면 훨씬 더 많은 것을 원했습니다. 또한 이것은 아마도 인간 치료법으로 번역 할 수없는 상당히 많은 양의 약물을 필요로했습니다.

 

그래서 우리는 드로잉 보드로 돌아가 인간 세포를 저용량 약물에 노출시킨 다음 RNA 염기서열 분석을 수행하여 스플라이싱 엑손 시스템에 통합할 수 있는 새로운 엑손을 식별했습니다. 

 

이 작업은 Alex뿐만 아니라 이러한 연구를 위해 모든 계산 작업을 수행한 Paul Ranum도 수행합니다. 따라서 여기에 나열된 후보자 중 하나는 빨간색으로 약물이 없는 경우와 파란색으로 약물이 있는 경우의 차이를 보여줍니다. 다시 말하지만, 이것은 더 번역하기 쉬운 저용량 약물입니다. 그리고 당신은 약물이 있는 상태에서 이 노란색 막대에 의해 새로운 엑손이 포함된 것을 볼 수 있습니다. 그리고 우리는 또한 스플라이싱 분석에 의해 평가된 포함의 양을 보고 이를 확인할 수 있습니다. 

 

그래서 여기 우리가 찾은 상위 2명의 후보자가 있습니다. 그리고 약물의 부재와 존재에서 엑손의 포함을 시사하는 또 다른 PCR 산물이 있음을 알 수 있습니다. 이 새로운 non-SMN200 미니 유전자 후보는 얼마나 반응성이 있습니까? 그래서 여기는 본질적으로 같은 구조입니다. 그러나 우리는 한 가지 트릭을 더 수행하여 시작 코돈을 포함 된 업스트림 엑손으로 옮겼습니다. 

 

약물의 부재, 엑손 포함 및 단백질 발현 없음. 그리고 약물이 존재하면 엑손 포접과 단백질 발현이 있습니다. 그리고 나는 당신이 지금 이것들이 정말로 많이 벗어났다는 것을 이해할 수 있기를 바랍니다. 이 후보자들 각각. 그리고 지금 우리의 유도 수준은 10이 아니라 <>입니다. 그리고 우리는 이것이 우리에게 더 세밀한 통제를 제공한다고 생각합니다, 왜냐하면 이제 우리는 약물의 복용량을 가지고 놀 수 있고, 우리는 다른 발기인과 모든 종류의 것들을 가지고 놀 수 있기 때문입니다. 

 

이거 정말 꺼져있어? 루시페라아제보다 시각적으로 조금 더 쉽게 볼 수 있는 또 다른 예가 있는데, 약물이 없는 경우 오른쪽 하단 패널에서 알 수 있듯이 약물이 있는 경우 GFP 발현이 없습니다. 다시 말하지만, 이것은 약물의 단일 펄스입니다. 강력한 GFP 발현을 볼 수 있습니다.

 

복용량과 약물의 복용량을 조절하기 위해 다른 프로모터를 보는 것은 어떻습니까? 다음은 RSV, PGK 및 mCMV의 세 가지 목록입니다. 그리고 다른 용량과 다른 프로모터를 사용하면 단백질 발현 수준이 다르다는 것을 알 수 있으며, 이는 수행 중인 실험에 필요한 발현 수준이 매우 낮을 때 유용할 수 있으며, 또는 짧은 기간 동안 매우 높은 배의 유도가 필요할 수 있고 더 강력한 프로모터가 필요할 수 있습니다.

 

그리고 이것은 다른 프로모터와 다른 용량 es에서 새로운 슈도엑손의 접합 수준이 다르다는 것을 보여주는 스플라이싱 분석입니다.

 

그래서 GFP 연구로 돌아가고 싶습니다. 우리는 시험관 내에서 좋은 GFP 데이터를 가지고 있었고 생체 내에서 움직이고 싶었기 때문에 Exxon이라고 부르는 이 시스템을 패키지화하고 단일 이식 유전자를 AAV로 만들고 이것을 생쥐에 주입했습니다. 이것은 IV 주사입니다. 

 

 

그리고 나서 우리는 조직을 분석했습니다 -- 그리고 저는 오늘 여러분께 그 조직들을 아주 조금씩 보여드리겠습니다. 그래서 우리는 AAV 주사를 하고 몇 주를 기다린 다음 여기에서 이 용량으로 LMI070을 단일 경구 투여했습니다. 5mg/kg 및 50mg/kg을 볼 수 있습니다. 그리고 비히클 처리된 동물에서 GFP 발현이 없다는 것을 알 수 있다고 생각하며, 저용량 및 고용량의 GFP 발현은 약물의 투여량에 비례합니다. 

 

그 사실을 확신시키기 위해 여기에 용량 반응 방식으로 EGFP의 수준을 볼 수 있는 웨스턴 블롯이 있으며, 이것이 진정으로 꺼져 있다는 것을 확신시키기 위해 우리는 이 웨스턴 블롯을 엄청나게 과다 노출시켰습니다. 그리고 약물이 없는 상태에서 이 동물들에 GFP 발현이 없다는 것을 알 수 있다고 생각합니다. 자, 우리가 여기서 실제로 관심을 갖고 있는 조직, 즉 뇌는 어떨까요? 동일한 엑손 e GFP 카세트를 고입자 친화성인 AAV/PHV로 재포장했습니다. 

 

우리는 이 복고풍을 생쥐에 궤도로 주입했고, 해마와 피질에 있는 두 개의 패널 시리즈를 감상할 수 있다고 생각하며, 5밀리그램과 50밀리그램 용량에서 모두 e GFP 발현이 강력하게 켜지는 것을 볼 수 있습니다. 그리고 스플라이싱 분석을 살펴보면, 비히클 처리된 동물에서 저용량 및 고용량의 엑손을 함유한 ATG의 스플라이싱이 본질적으로 없음을 알 수 있습니다. 

 

우리는 다양한 수준의 접합을 가지고 있습니다. 그리고 그 아래에는 정량적 PCR로 평가한 접힘 유도가 있는데, 이는 여기와 관련이 있습니다. 다시 말하지만, 우리는 킬로그램 당 180 밀리그램으로 5 배 유도를하고, 고용량에서 전사체 수준을 기준으로 1,000 배 이상의 유도를 얻습니다. 그리고 이것은 다시 이 동물들에게 단일 경구 투여를 한 다음 동물들을 안락사시켰습니다 -- 약 하루 후.

 

그렇다면 우리는 왜 시스템을 개발 했습니까? eGFP를 가진 사람들을 치료하기 위한 것이 아니었습니다. 대신 표현된 Cas9의 수준을 제어하고 그 맥박을 가질 수 있어야 했습니다. 그래서 저는 여러분께 그 데이터 중 하나를 보여드리겠습니다. 우리는 본질적으로 eGFP를 cas9로 대체했습니다. 

 

그리고 우리가 알고 싶었던 것은 시스템에서 구성적으로 con과 유사한 편집에 충분한 수준으로 cas9를 유도했는지 여부입니다. 먼저 웨스턴 블롯으로 구성적 발현 수준 또는 약물의 다양한 용량 전환을 평가했습니다. 이것은 모두 시험관 내입니다. 

 

마약이 없을 때 볼 수 있습니다. cas9 표현식이 없습니다. 그리고 우리가 약물의 복용량을 증가시킴에 따라, 우리는 구성적 표현의 수준까지 올라갈 수 있습니다. 그리고 우리가 이것을 사용하여 대립 유전자 특이적 가이드 RNA가 있는 상태에서 cas9을 제어할 때, 우리의 희망은 구성 시스템에서 보았던 침묵 수준을 얻는 것입니다. 그래서 여기에 대립 유전자 특이적 방식으로 헌팅턴을 침묵시키는 cas9를 구동하는 엑손의 능력을 평가할 때의 전사체 수준이 있습니다. 

 

그리고 제 생각에 여러분은 여기서 이해할 수 있을 것 같아요 -- 그래서 왼쪽에는 대조군 가이드가 있고 약물이 없고, 다음 회색 막대는 가이드이지만 약물은 없습니다. 주황색 막대는 컨트롤입니다. 제어 가이드. 그리고 녹색 막대는 헌팅턴 전용 가이드, 플러스 마이너스 및 플러스 LMI070입니다. 

 

그리고 약 50%의 감소 수준은 우리가 엑손 시스템을 사용하든 구성 시스템을 사용하든 일관된다는 것을 알 수 있다고 생각합니다. 그래서 이것은 매우 흥미롭고 안전상의 이유로 앞으로 나아가고 싶은 것입니다.

 

앞으로 나아가기 위한 도전은 규제이며, 저는 우리가 거기에 도달하고 있다고 생각합니다. 다시 말하지만, 뇌 침투 가능한 경구 생체 이용 가능한 약물로 유전자 발현을 미세하게 제어합니다. AAV의 경우 캡시드입니다. 그래서 우리는 효능 향상을 위해 지속적인 엔지니어링을 수행하고 있는 실험실에서 몇 가지 노력을 기울이고 있습니다. 그리고 이것은 몇 가지 긍정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 첫째, 광범위한 제조에 대한 필요성을 줄여 비용을 절감할 수 있습니다. 

 

다른 하나는 우리가 정말로 원하지 않는 세포 전체가 아니라 올바른 세포로 우리를 데려간다는 것입니다. 또한 조절 된 시스템과 함께 올바른 세포에서 적절한 수준의 발현을 제공 할 수 있습니다. 그렇다면 올바른 캡시드를 엔지니어링하는 방법은 무엇일까요? 우리의 전략은 응용 프로그램에 따라 다릅니다. 어떤 경우에는 전체 뇌가 퇴화하기 때문에 모든 곳으로 이동하는 AAV를 원합니다. 

 

그래서 이를 위해 우리는 다양한 혈청형을 기반으로 AAV 라이브러리를 만들었습니다. 각각의 혈청형 라이브러리는 약 10 내지 7번째 정도의 뚜렷한 캡시드 분산이다. 우리는 이것을 뇌척수액에 주입합니다. 그리고 이들은 인간이 아닌 영장류에 있습니다. 우리는 이것을 뇌척수액에 주입하고 몇 차례의 진화를 거쳐 그 조직을 수집한 다음 우리가 회복한 캡시드를 차세대 시퀀싱에 적용합니다. 

 

이것은 아마도 15개의 숫자를 차지할 수 있기 때문에 몇 가지 예를 보여드릴 것이지만, 우리가 의도한 것에 더 적합한 캡시드를 식별하기 위해 이것을 어떻게 사용할 수 있는지 강조하기 위해 하겠습니다. 따라서 이것은 검증을 거친 AAV 혈청형 중 하나의 예일 뿐입니다. 그리고 이 행들 각각은 서로 다른 캡시드 변종입니다. 그리고 보라색의 밀도로 볼 수 있는 것은 해당 입력에 대한 접힌 농축입니다. 그리고 이것은 아마도 약 150개의 다른 캡시드의 마지막 라운드 이후의 입력입니다. 그리고 일부 변종은 변연계, 일부는 후뇌, 일부는 감각계 등에 매우 좋은 것으로 보입니다. 그리고 이들 각각에 대해 우리는 들어가서 우리가 진행하면서 그것들을 검증할 수 있습니다. 

 

그렇다면, 우리가 이것이라고 부르는 최고의 펩타이드 변형 AAV는 최첨단과 어떻게 비교됩니까? 인간과 다른 큰 동물의 모든 실용적인 목적을 위해 AAV9로 알려져 있습니다. 그래서 여기 펩타이드 변형 AAV의 예가 있습니다.이 AAV는 아직 데이터를 볼 수 없으며 야생형 AAV9입니다. 뇌척수액에 주사 한 후. 해마의 한 영역을 보여드리겠습니다. 그것은 이식 유전자 M 루비를 구동하는 강력한 프로모터입니다. 이것은 인간이 아닌 영장류의 뇌척수액으로 전달된 지 4주 후입니다. 

 

여기에서 적혈구가 흩어져 있는 것을 볼 수 있다고 생각하지만, 정말 인상적인 것은 해마 내의 펩타이드 변형 AAV와 이 영역 내의 강력한 형질도입을 비교한다는 것입니다. 그래서 우리는 향상된 형질 도입을 제공하여 훨씬 더 낮은 용량으로 유전자 치료를 할 수 있게 해주는 이러한 종류의 광범위한 스펙트럼 펩타이드 변형 AAV에 대해 매우 기쁘게 생각합니다. 

 

네트워크 수준 표현을 위한 엔지니어링 벡터는 어떻습니까? 그리고 이것은 행동의 변화를 줄 수 있거나 신경 퇴행성 질환이나 다른 정신 건강 장애에 특히 영향을 줄 수있는 네트워크를 제어하고자 할 때 중요 할 수 있습니다. 다시 말하지만, AAV 펩타이드 라이브러리와 동일한 시작 접근 방식입니다. 그리고 여기서 우리는 네트워크 노드에 실질 주입을 한 다음 차세대 시퀀싱을 통해 두 라운드를 통해 다시 필수 진화를 수행합니다. 그리고 저는 그 se에서 나온 약 150개의 캡시드 변이체에 대한 중간 수준의 검증 실험을 보여드리고 있습니다Cond-Round 라이브러리. 왼쪽에는 AAV, AAB 및 AAVC의 세 가지 라이브러리가 있으며 이러한 다양한 종류의 라이브러리에 대한 상대적 접기 강화를 볼 수 있습니다. 

 

그리고 이것은 또한 네트워크의 작은 a에서 작은 f까지의 영역에서 나타나며, 우리는 이 네트워크 내에서 커버리지를 확보하여 한 번의 주입을 한 다음 영향을 미치고 모든 관심 지역에 바이러스를 퍼뜨릴 수 있기를 희망합니다. 그래서 여기에 화살표로 강조 표시된 이들 각각은 이제 최종 검증 연구에서 진행되고 있으며, 단일 정위 주입에서 이러한 속성을 다시 본 다음 어디로 가는지 따라가는 것은 매우 흥미로울 것입니다. 따라서 앞으로 나아가는 과제는 규제입니다. 

 

우리는 거기에 도달하고 있습니다. 유전자 발현의 미세 조절, 다시 말하지만, 이 경구용 약물과 AAV의 경우 우리는 많은 진전을 이루고 있다고 생각합니다. 우리는 진행중인 진화 연구를 단일 세포 방법론과 병합하여 지역 수준뿐만 아니라 세포 수준에 도달하는 상태에 있습니다. 그리고 나서 우리는 적어도 작은 동물 모델에서 향성을 평가하는 더 나은 방법을 개발하는 데 몇 가지 작업을 개척했으며, 이는 우리가 가고 싶은 곳에 도달하고 있을 뿐만 아니라 가고 싶지 않은 곳으로 가고 있지 않다는 표시를 제공하는 데 도움이 됩니다. 그리고 제가 보여드릴 몇 가지 실험에 놀라실 거라고 생각합니다. 자, 이것의 대부분은 뇌에 있지 않습니다. 뇌에는 약간의 것이 있지만 그럼에도 불구하고 관련이 있습니다.

 

그래서 우리가 AV가 어디로 가는지 보는 전통적인 방법은 기자를 표현하고 동물에 넣은 다음 그것이 어디에 있는지 보는 것입니다. 

 

예를 들어, 간을 형질도입하는 무언가를 찾고 있다면, AAV 벡터를 사용하여 e GFP를 발현하고 이를 사용하여 크리를 발현하여 시퀀스를 뒤집을 수 있지만, 여기서 우리가 한 것은 이 Cre 주입 eGFP를 취한 것이고 우리는 이 작업을 수행한 Jon Lang이 수정된 화면이라고 부르는 것을 했습니다. 플록스 스톱 업스트림 TD 토마토가 있는 A14 마우스가 있고 동일한 바이러스를 주입하면 이제 안정적인 형질도입 사건이든 일시적인 형질도입 사건이든 바이러스에 감염된 모든 세포에 태그를 지정할 수 있습니다. 

 

이것이 실용성에서 어떻게 작동합니까? IV Cre eGFP를 주입하고 GFP를 찾을 때 GFP 발현의 용량 의존적 증가를 볼 수 있는 것은 다음과 같습니다. 그리고 이것은 단지 정상적인 검은 아픈 쥐입니다. AI14 마우스를 사용하면 모든 간세포가 붉다는 것을 알 수 있습니다. 그리고 사실, 이것을 정량화하면 기껏해야 볼 수 있는 회색 막대의 표준 형질도입에서 형질도입된 비율이 간의 약 20%를 얻지만 실제로 우리가 보고 있는 것은 간세포의 거의 100%가 형질도입되고 표준 선별 방법을 사용했다면 완전히 놓쳤을 것입니다. 

 

우리는 더 많은 AAV 게놈을 세포에 주입하는 것이 가능한지 물었습니다. 그리고 그것은 사실이 아닌 것으로 판명되었습니다. 그렇다면 우리가 조직 전체, 특히 IV 주사를 볼 때 이것이 얼마나 관련이 있습니까? 그리고 일부 뇌 유전자 치료의 경우 뇌 트로픽 바이러스로 IV 주사가 이루어지고 있으며 대부분의 바이러스가 그곳으로 가고 있다고 생각하며 말초적으로 증가하는 것은 대부분 제거되거나 어느 정도 이해합니다. 

 

그래서 여기서 우리는 표준 마우스 모델에서 Cre에 대한 e GFP 보기를 표현하는 AV8과 함께 다시 있습니다. 뇌에서는 아무것도 볼 수 없고, 심장에서는 조금, 폐에서는 아무것도 볼 수 없으며, 간에서 기대하는 것과 같은 양을 볼 수 있습니다. 아래의 다른 조직, 신장, 비장, 골격근 또는 고환에는 아무것도 없습니다. 그러나 우리가 Ai14 마우스를 사용할 때, 우리는 뇌에 혈관이 생기고, 심근 세포가 꽤 많이 생기고, 확실히 폐의 세포에 부딪히는 것을 알 수 있다고 생각합니다. 다시 말하지만, 우리의 간은 100 %입니다. 간세포의 100 %가 바이러스를 흡수했습니다. 우리는 신장에서 사구체를 봅니다. 비장 양성 우리가 보는 면역 반응의 일부를 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 골격근은 양성이고 고환의 지지 세포는 양성입니다.

 

편집에 동일한 시스템을 사용하는 것은 어떻습니까? 제가 처음부터 이 강연에 참석했을 때, 헌팅턴병과 유사한 기능 장애의 지배적 이득을 위한 DNA 편집 접근법을 발전시키는 것에 대해 생각했던 것을 기억하기 때문입니다. 

 

그래서 우리는 여기에 또 다른 마우스를 사용했는데, SPS cas14을 발현하는 Ai9 마우스를 다시 사용했고 가이드를 표현한 바이러스를 가지고 돌아와서 편집이 가능한 곳은 어디입니까? 그리고 그것은 정말로 놀랍습니다. 다시 말하지만, 우리는 소뇌, 심장, 폐, 실제로 우리가 분석한 모든 조직의 뇌에서 편집이 이루어지는 것을 보고 편집의 증거를 보았습니다. 

 

우리는 간 특이적 프로모터의 첫 번째 실험에서 Cre를 몰았을 때 편집 또는 발현의 증거를 보았습니다. 그래서, 아시다시피, 이 연구가 우리에게 강조하는 것은 우리가 기존의 스크리닝 방법으로는 깨닫지 못했던 이 조직에서 우리가 실제로 얼마나 특이하고 얼마나 많은 유전자 전달을 얻고 있는지입니다. 

 

흥미롭게도 대립 유전자 특정 편집에 대해 생각하고 있다면 이 기술을 사용하여 실제로 두 대립 유전자를 얼마나 효과적으로 편집하고 있는지 확인할 수도 있습니다. 그리고 우리는 두 대립 유전자를 모두 치는 데 그다지 좋지 않다는 것이 밝혀졌습니다. 그래서 이것은 심장과 다른 말초 조직에서 AAV 9를 사용하고 뇌에서 AAVB를 사용하여 피질, 선조체, 해마 및 소뇌를 사용하는 예입니다. 이중 편집된 셀은 거의 없지만 대부분 빨간색 또는 녹색이 있는 단일 편집이 있음을 알 수 있습니다. 

 

그리고 이것이 우리가 생체 내에서 돌연변이 대립 유전자를 편집하는 데 얼마나 효율적인지 알려주는 데 중요할 것이라고 생각합니다. 요약하자면, 제가 질문할 시간을 충분히 남겨두었기를 바라며, 질병 대립유전자의 대립유전자 특이적 편집은 세포와 동물에서 이루어질 수 있습니다. 우리는 녹다운을 조절하기 위한 접근 방식을 발전시켰고, 본질적으로 사람, 어린이에게 있는 경구 생체 이용 가능한 약물과 함께 사용할 수 있는 가변 저항기를 생성했으며, 이는 약물 기반 조절 방법을 제공합니다. 

 

우리는 또한 세포의 상태가 발현을 조절하는 방법을 고안하고 있습니다. 그리고 우리는 집중적이거나 광범위하거나 심지어 네트워크 수준의 변환을 위한 새로운 벡터를 식별할 수 있었습니다. 그리고 이것들이 등장함에 따라 우리는 하부 동물 모델로 돌아가 형질 도입의 발자국을 평가할 것이라고 생각합니다. 그리고 지금까지, 우리가 인간이 아닌 영장류에서 발견한 모든 것은 실제로 꽤 잘 번역되었습니다. 흥미로운 것은 진화 작업이 생쥐에서 일어 났기 때문에 더 큰 동물 모델로 변환되지 않았기 때문입니다.

 

제 연구실 구성원들에게 감사드리며, 물론 이 작업을 위한 자금은 NIH와 필라델피아 연구소 아동 병원, 그리고 Herd Disease Found Days 및 Hopi's Hope와 같은 재단입니다. 그리고 좋은 소식을 들은 후 행복한 순간이 왔다고 생각합니다. 그리고 이것은 분명히 우리가 함께 모일 수 있었던 COVID 이전이었고, 아마도 방의 인구를 초과하여 매우 높은 밀도를 가졌을 것입니다. 

 

그래서 어떤 질문이든 기꺼이 받아들입니다. 여기에서 질문을 볼 수 있고 검토를 시작할 수 있습니다. 맨 위부터 시작하겠습니다. Ryan은 작은 분자를 사용하는 작은 분자 조절 스플라이싱의 번역 생존 가능성에 혼란스러워한다고 말합니다. 또한 내인성 유전자를 조절합니까? 시스템이 목표를 벗어난 효과를 가질 것 같습니다. 라이언, 정말 좋은 질문입니다. 그래서 이 작은 분자는 분명히 조절할 것입니다 -- 

 

또는 우리가 선별한 이 낮은 용량에서 소수의 유전자의 스플라이싱을 유도할 것입니다. 다시 말하지만, 자살 엑손이 포함된 유전자는 소수에 불과합니다. 그리고 그것은 세포에서 꽤 짧습니다. 그래서 아이디어는 우리가 인간에게 부작용을 일으키지 않을 유전자 발현을 조절하기 위해 복용량을 사용하고 있다는 것입니다. 그리고 우리는 많은 인간 데이터를 알고 있습니다, 아주 솔직히, 이것은 아이들에게 몇 년 동안 사용되어 왔기 때문입니다.

 

Jim Bloss는 치료가 취소된 이유를 물었습니다. 그리고 저는 그가 헌팅턴병에 대한 대립유전자 비특이적 로슈 연구와 헌팅턴병에 대한 파동 연구를 언급하고 있다고 생각합니다. Roche 연구는 내가 아는 한 종점을 충족하지 못했습니다. 그리고 웨이브 연구는 아무런 증거도 보여주지 못했습니다 -- 다시 말하지만, 이것은 모두 웹사이트에 있습니다. 그래서 내가 아는 것은 내가 보는 것뿐입니다. 그리고 Wave의 경우 주입 후 Huntington이 낮추거나 표적 참여를 했다는 증거가 없었습니다. 

 

Jim은 또한 뇌에서 헌팅턴의 50%가 견딜 수 있는 이유에 대해 좀 더 자세히 설명해 주시겠습니까? 이것은 마우스의 녹아웃 실험과 다른 접근법을 사용하는 다른 녹다운 실험에서 나온 것입니다. 따라서 헌팅턴의 전체 수준을 50% 감소시키는 것은 해로운 것으로 보이지 않으며, 헌팅턴이 결핍된 동물, 즉 이형접합 동물이 있다면 괜찮습니다. 사무엘은 유전 적 개입이 몇 살에 시행 될 것이라고 말합니다. 개입의 결과로 기존의 신경 퇴행이 역전됩니까? 좋은 질문입니다. 

 

헌팅턴병의 경우 일찍 가야 한다고 생각합니다. 경미한 퇴행 또는 중등도 위축에서 중증으로 진행되는 질병의 진행이 있으며, 아마도 중등도 위축 단계 즈음에 있을 것입니다. 나는 Roche와 Wave가 초기에 작성하거나 조금 더 일찍 작성했다는 점에서 두 사람이 설정한 연구와 유사하다고 생각합니다. 커트... 모든 의견 -- Kurt Fishbeck -- 안녕하세요, Kurt. AAV 독성에 대한 의견이 있습니까?

 

네, 그래서 우리가 AAV 진화 시스템에서 작업하고 있는 것 중 하나는 우리가 원하는 곳으로 진화시키는 것뿐만 아니라 우리가 원하지 않는 곳으로 가지 않도록 진화시키는 것입니다. 그리고 이 경우 특히 성인에서 AAV9에 약간의 독성이 있는 것으로 보이는 후근 신경절 세포를 언급하는 것일 수 있다고 생각합니다. 

 

그리고 여기에서 사용한 방법론을 사용하여 해당 영역을 좋아하는 경향이 있는 캡시드를 선택 취소할 수 있다고 생각합니다. Jim은 다시 물었습니다, 정신 분열증과 같은 SMI를 연구하는 데 CRISPR 연구를 사용하는 다른 연구를 알고 있습니까? 만약 그렇다면, 당신은 그 연구들과 아마도 그들의 연구의 결과들을 확인할 수 있나요? 

 

저는 아니에요. 그러나 저는 정신 건강 분야의 여러 연구자들과 대화를 나눴고, 아시다시피, 문제는 영향을 미치기 위해 시도하고 조절하는 것이 단일 유전자인지 아니면 여러 유전자인지입니다. Jonathan은 개정된 AAV 스크리닝에서 그렇게 많은 세포가 형질도입되어 Cre와 RP를 발현할 수 있다면 왜 동일한 세포가 GFP를 발현하지 않는지 묻습니다. 좋은 질문입니다. 

 

그들이 GFP를 표현하지 않는 이유는 이것이 일시적이기 때문입니다. 그리고 이것이 편집, 특히 CRISPR을 사용한 핵 편집과 관련이 있습니다. 따라서 모든 형질도입 사건이 안정적인 것은 아니지만, 이 데이터는 우리가 전혀 몰랐던 많은 형질도입 사건이 발생하고 있음을 보여주며, 이는 편집과 정말 관련이 있습니다.

 

그리고 그는 계속해서 AAV의 복제 수가 너무 낮아 GFP 발현을 볼 수 없다고 말합니다. 정확하게. 그리고 그것이 아름다움입니다, 왜냐하면 그것이 의미하는 바는 우리가 무언가에 대한 편집 전략을 사용할 때 안정적인 형질 도입을 위해 간에서 유전자 치료를 위해 초고용량이 필요하지 않다는 것입니다. 

 

우리는 효과를 내기 위해 규모 이하로 갈 수 있습니다. 그리고 저는 이것이 우리가 시스템을 인간에게 전진시키는 것과 관련이 있다고 생각합니다. Ryan은 Ai 14 모델 분석을 사용하여 엑손 전사 제어 시스템을 테스트했습니까? 아니요, 그렇지 않습니다. 그리고 그것은 좋은 제안입니다. 감사합니다. 그리고 제가 말하고 싶은 것은 기각된 것이 있다고 생각합니다 -- 그것은 말합니다 -- Jim은 말합니다, 

 

저는 이 수준의 과학적 세부 사항을 따라잡을 수 있는 우리 서명자들의 능력에 매우 감명을 받았습니다. 그리고 서명자들에게도 축하의 인사를 전합니다.

 

>> ALEXANDER DENKER: 훌륭한 강연을 해주셔서 감사합니다. 그리고 저는 서명자들의 능력에 동의하며, 우리의 모든 전문 용어를 다룰 수 있는 훌륭한 수화 통역사 팀을 모집합니다. 다른 사람이 Q & A 상자에 글을 쓰고 싶다면 질문 할 시간이 더 많지만, 작업의 비즈니스 측면과 특정 유전자 치료를 언제 진행해야하는지 여부를 결정하는 데 필요한 사항에 대해 조금 언급 할 수 있는지 묻고 싶습니다.

 

>> 비벌리 데이비슨: 맞아요. 돈. 그래서, 학자로서, 예, 우리는 매우... 우리는 힘들게 만들어야 합니다... 아시다시피, 회사도 마찬가지이지만 우리는 더 작은 지갑을 가지고 있습니다. 그리고 우리에게 필요한 것은 데이터가 정말로 설득력이 있어야 한다는 것입니다. 

 

그런 다음 우리는 나가서 I & D 지원 연구를하기 위해 돈을 모금합니다. 그리고 I&D 지원 연구가 다음 단계로 나아가는 데 도움이 된다면 생명공학이나 제약사와 협력하거나 사내에서 진행하려고 노력하는 것입니다. 우리는 CHOP에서 I & D 활성화 단계를 통과 할 수있는 GFP 제조 시설을 갖게되어 매우 운이 좋았습니다. 

 

그러나 우리는 여전히 모든 제품과 임상 시험 비용을 지불하기 위해 돈을 모아야 합니다. 그리고 제가 NIDMS의 자금 지원으로 노력한 것 중 일부는 약 10년 동안 클리닉에 몇 가지 유전자 치료법을 발전시킨 것입니다.

 

>> ALEXANDER DENKER: 감사합니다. CHOP에서 당신은 분명히 매우 취약한 인구, 어린이 및 그 가족과 함께 일하고 있습니다. 가족에게 표현하고 이러한 실험적 치료법을 설명하고 위험을 감수하는 측면에서 직면하는 어려움은 무엇이며 자녀와 가족에게 가치가 있는 이유는 무엇입니까?

 

>> 비벌리 데이비슨: 물론입니다. 의사가 아닌 저는 이러한 환자를 못하지만 이러한 환자를 돌보는 의사 과학자 및 의사와 긴밀히 협력합니다. 그

리고 저는 우리가 이러한 치료법의 위험에 대해 100% 솔직해야 한다고 생각합니다. 우리는 지나치게 약속 할 수 없습니다. 

 

아시다시피, 이것들은 이 단계에서 실험적인 치료법이며 우리는 긍정적인 영향을 미치고 이러한 개인의 질병 부담을 줄이기를 희망합니다. 유전자 치료는 많은 가능성을 가지고 있다고 생각합니다. 아시다시피, 우리는 매우 심각한 질병으로 큰 성공을 거둘 수 있었습니다. 

 

아시다시피, 저는 SMA 이야기가 그 예라고 생각합니다. 그러나 우리가 사용할 수 있는 현재 제품군 벡터에 최소한이 아닐 수 있는 많은 장애가 있으며 우리가 하는 일에 대해 현명해야 하며 근본적으로 이해하고 우리가 어린이로 이동하기 전에 이 환자들에게 긍정적인 영향을 미칠 수 있다고 확신해야 합니다.

 

>> ALEXANDER DENKER: 감사합니다. 상자에 들어온 또 다른 질문이 있습니다. 이제 몇 가지 질문이 있습니다.

 

>> 비벌리 데이비슨: 맞아요. 안토니... 네, 원하시면 읽어드릴 수 있습니다.

 

>> ALEXANDER DENKER: 물론입니다.

 

>> 비벌리 데이비슨: Anthony는 접근 방식이 더 큰 동물 모델에서 평가되었거나 가까운 장래에 계획된 경우 유사한 형질도입 적용 범위가 예상되는지 묻습니다. 나는 대답 할 것이다. 그래서 우리가 진화 실험에서 하고 있는 모든 작업은 큰 동물 모델에 대한 것입니다. 작은 동물 모델에는 없습니다. 

 

그러나 우리는 큰 동물 모델을 표현하는 Cre가 없기 때문에 아직 대형 동물 모델에서 형질 도입의 발자국을 평가할 방법이 없습니다. 그러나 우리는 Cas로 그렇게 한 다음 편집을 평가할 수 있습니다. Roche의 연구가 실패하면서 불충분 한 형질 도입으로 인해 억제가 불충분 해졌습니까? Roche의 연구는 요추 천자를 통해 올리고 뉴클레오티드를 CSF에 주석 융합하는 것입니다. 

 

매월 또는 격월로 반복적으로 제공됩니다. 그리고 헌팅턴이 치료로 인해 뇌척수액이 낮아졌다는 증거가 있으므로 이점이 있을 것이라고 가정할 수 있습니다. 우리가 이해하지 못하는 것은 헌팅턴이 어디에서 오는지, 돌연변이 헌팅턴이 어디에서 왔는지, 뇌의 어느 부분 또는 척추의 어느 부분인지, 그리고 그것이 ASO가 어디로 가고 있는지를 반영하는지 여부입니다. 그래서 저는 안티센스 올리고뉴클레오티드 요법의 경우에 우리가 이해하지 못하는 것이 정말 많다고 생각합니다. 

 

mRNA 저하 요법은 우리가 수년 동안 연구했으며 척추 발작에 대해 계속 연구하고 있습니다. 그것은 Unicure와 함께 생각하는 클리닉에 효과가 있었습니다. Jonathan은 CRISPR 매개 이중 가닥 절단이 염색체 재배열을 유발하는 것으로 나타났는지 물었고 이것이 저와 관련이 있는지 물었습니다. 예, 그것은 나를 염려 할 것입니다. 그리고 우리는 솔직히 말해서 활성 CRISPR에 무슨 일이 일어나고 있는지 평가하는 과정에 있습니다. 

 

지금까지 수행된 모든 작업은 생체 내에서 대부분 바이러스 전달 CRISPR로 수행되었습니다. 그래서 이것은 구성적으로 켜져 있습니다. 그리고 활발한 편집과 바이러스 게놈이 있고 장기간 켜져 있는 경우 부당하고 원치 않는 편집 사건이 발생할 가능성이 높아질 것이라고 생각합니다. 이것이 제가 이 규제된 표현이 매우 중요하다고 생각하는 이유입니다. 짧은 시간 동안만 필요하고 수차 횟수를 줄여야 하기 때문입니다. 다른 대안적 접근법은 활성 뉴클레아제를 전혀 사용하지 않고 유전자 침묵 또는 돌연변이 대립유전자 발현을 억제하는 다른 변경을 위해 기계를 관심 영역으로 안내하는 CRISPR의 능력을 활용하는 것입니다. Ryan은 바이러스 벡터를 사용할 때 투여 문제에 대한 의견이 있고 면역 억제를 넘어서는 좋은 완화 전략이 있는지 물었습니다. 

 

간 및 말초 조직에 대한 재도싱을 허용하는 항-A AV 항체의 일시적인 감소를 조사한 최근 논문이 있습니다. 뇌에서는 언제 다시 일어날지 확신할 수 없습니다. 크리스 반 코비치 (Chris Bankovitch)의 자료에 따르면 발현은 적어도 10 년 동안 유지되며 이는 인간이 아닌 영장류에서 발생합니다. 그래서 우리는 그것이 줄어들 것이라고 생각하지 않습니다. 

 

그렇기 때문에 우리는 편집 기계로 유전자 발현 수준을 제어해야 한다고 생각합니다. 그리고 뇌에서 명심해야 할 또 다른 것은 우리가 항체 반응을 유도할 수 있는 동안 우리가 걱정하고 싶은 것은 중화 항체가 아니라 세포 매개 독성이며 뇌의 독성 유도에 대해 완전히 이해할 필요가 있다는 것입니다. 

 

그것은 일어나지 않았습니다. 특히 유전자 대체에 대한 뇌의 가장 큰 다른 관심사는 개인이 이전에 본 적이 없는 재조합 단백질에 대한 항체를 개발하는 것입니다. 그리고 그것이 바로 면역억제가 항체 반응을 억제하여 단백질이 해야 할 일을 하는 능력을 중화시키는 데 매우 좋은 역할을 하고 있다고 생각합니다.

 

>> ALEXANDER DENKER: 정말 고맙습니다. 오늘 시간을 내주셔서 감사합니다. 그리고 NIMH는 당신이 시간을 할애할 수 있어서 매우 기쁩니다. 직접 만나지 못해서 미안하지만이 매체에서도 효과가 있다는 것에 감사드립니다.

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